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重组酶聚合酶扩增（RPA）技术是一种新颖的核酸恒温扩增方法，可在37-42°C温度下，完成10-30分钟内对目标核酸的快速检测。相比PCR技术，RPA技术具有高度敏感性、特异性，对仪器依赖性较低，能整合多种检测模式，特别适合基层及现场即时检测，广泛应用于体外诊断、动物疫病、食品安全、生物安全、农业等领域。检测灵敏度高，无需昂贵设备，样本耐受性高，检测方法多样化。
RPA/RAA技术原理包括重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)及链置换DNA聚合酶参与。反应过程中，重组酶与引物结合形成复合物，寻找双链DNA中的同源序列。接着通过重组酶的链置换活性将引物插入同源位点，SSB稳定置换DNA链，重组酶分解后，引物3'末端被链置换并与聚合酶结合，延长引物，实现目标区域的指数式扩增。整个过程通常在10分钟内完成。
重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种由Piepenburg等人在2006年研发的核酸恒温扩增技术，它利用参与细胞DNA合成的蛋白重组和修复的原理。与传统PCR循环扩增方式不同，RPA在37-42°C条件下进行操作，仅需少量样本即可在10分钟内将低至1-10个DNA拷贝扩增，具有高灵敏度、可选择性、便携性、快速性以及多重扩增的能力。RPA广泛应用于多种靶标的扩增，包括RNA、miRNA、ssDNA和dsDNA。
RPA的工作原理是利用重组酶与寡核苷酸引物形成蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列，一旦定位到同源序列，就会发生链置换反应启动DNA合成，对模板上的靶标进行指数式扩增。单链DNA结合（SSB）蛋白与置换的DNA链结合形成的D环，防止进一步替换。整个扩增反应迅速，从几个目标DNA拷贝开始，在几分钟内即可达到可检测水平。
RPA包含三种关键酶/蛋白：与引物结合的重组酶、单链结合蛋白（SSB）与链置换DNA聚合酶。这种技术的优点包括简单快速、灵敏度高、特异性好、恒温扩增、样本包容性广、成本低、以及广泛的适用性。RPA可以在37-42°C的条件下快速扩增DNA，通常一个未经专业训练的人员可以在半小时内完成样本的采集、准备和实验检测。RPA可以检测复杂样本中的单拷贝DNA，甚至低于10个拷贝的RNA，无需进行核酸纯化。RPA技术能检测和扩增来自不同物种复杂基因组中的单个DNA分子。此外，RPA在常温下反应，操作简单，可以在25°C条件下在一个小时内获得扩增结果。RPA可以处理多种样本类型，甚至可以直接处理未经核酸纯化的血液或鼻拭子，只需进行热或碱处理促进核酸释放即可。
RPA引物设计时需考虑引物长度、序列、GC含量以及避免形成二级结构或发夹结构的序列，以减少引物二聚体的形成。一般RPA引物长度为30-35nt，常规PCR引物也可用于RPA。引物设计时，5’末端应避免连续G，最好是胞嘧啶，以促进片段重组；3’末端最好是GC，以提高扩增性能；GC含量应在30-70%之间；引物设计时应避免形成易形成二级结构或发夹结构的序列。
作者：谭璞（单位：密歇根大学生物医学工程系）
新型冠状病毒（2019-nCoV）引发的疫情引起了全国乃至全世界人民的关注。其中，有一个问题引发了广泛讨论：为什么确诊人数在2020年1月18日之后出现了爆发性增长？中国为什么能快速检测新冠病毒？
作为生物检测技术的研究者，笔者希望借此机会跟大家探讨一下，如何诊断一个新发病原体，如何快速检测新冠病毒。
医生在采样。新华社发
核酸检测需要多久
1月9日，本次不明原因的病毒性肺炎病例的病原体初步判定为“新型冠状病毒”，能否快速，准确地检测到它，成为防控的关键。
在特异性的诊断方法出现之前，只能根据患者体征找到一些疑似病例。很不幸的是，这次的新型冠状病毒肺炎症状上特异性不强。与SARS相比，此次肺炎起病并不很急，有些患者甚至没有出现高烧。在这个流感横行的季节，单靠病人体征这种太过粗糙的方法区分新型冠状病毒感染者是非常困难的事。
1月16日，首批针对新型冠状病毒生产的PCR试剂盒下发到各省级疾控中心，这是近几日出现确诊病例数量快速增长的直接原因。
冠状病毒检测PCR试剂盒的工作原理大致是：通过提取病人样本中的RNA，进行反转录·聚合酶链反应（RT-PCR），通过扩增反应将样本中微量的病毒信息加以放大，最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性，那么就可以说样本中存在病毒（已经感染），反之则说明没有感染。
医护人员在工作。新华社发
一次检测需要多长时间
初期大约需要16小时（本文数据根据常规的实验室操作时间推测，不代表实际用时）。
引发本次肺炎的新型冠状病毒，和它的近亲SARS，MERS一样，遗传信息都是由单链RNA构成。想要完成对它的检测，至少需要经过提取病毒RNA，和逆转录PCR（RT-PCR）两步。提取病毒RNA本身也包含裂解样本，提纯RNA等多个工序，需要花费数小时。而RT-PCR，一般来说也需要至少三四个小时才能完成。整套工序流水线操作的话，总共大概需要一个工作日，即6-8小时左右，检测结果都需要经过复核，重复实验则需要花费双倍的时间。
这样算下来，从1月16日湖北省收到国家疾控中心下发的试剂盒到1月18日通报第一批检测结果，负责检测病毒的工作部门可以说是马不停蹄了。在此基础上，目前有机构开发出了简化版的试剂盒，可将单次检测的时间缩短到约3小时。
怎么研发生产试剂盒
有的朋友可能还有疑问，从发现第一例患者到试剂盒下发，中间经过了一个月左右，研发生产试剂盒为什么需要这么久？
其实，已经很快了，我们来捋一捋试剂盒的开发流程：
病原分离和排查：此次导致疫情的病原是一种全新的冠状病毒。在确认这是一种从没有见过的病原之前，需要排除掉所有已知病原：包括各类流感病毒（甲型流感、禽流感等），容易导致普通感冒的腺病毒，鼻病毒和已知能导致肺炎的冠状病毒（SARS、MERS），衣原体，支原体等等。
设计引物：这是非常关键的一步，只有设计出适当的引物，才能进行病毒检测的PCR反应。科学家需要对这个新找到的病毒进行全基因组测序和生物信息学分析，设计引物（就是一段DNA序列），验证它的特异性，敏感性，确保它只能识别新型冠状病毒基因。
工业化生产：可以说，除了引物，所有病毒核酸检测试剂盒中的其他组分都是一样的，所以大量合成适当的引物就是工业化生产试剂盒的关键。
病原分离和排查需要花费至少一周的时间，测序和生物信息学分析也需要三天左右。探针设计与特异性检查又需要两三天。也就是说，在一切都非常顺利的情况下，也需要将近两周的时间才能把设计好的引物投入工业化生产。目前，我国工业化DNA合成技术已经推广得非常普遍，一两天的时间足可以生产出大量的产品（有些小剂量定制产品甚至可以当日送达）。综合各方面信息来看，这次疫情，我国最起码在检测手段的开发上做到了近乎完美的快速响应。
除了核酸检测，蛋白检测也在路上
除了目前卫生系统所采用的核酸检测方法以外，基于病毒蛋白的检测技术也可以在病原的快速检测上起到很大作用。
在DNA/RNA携带的遗传信息之外，病毒的蛋白外壳同样也携带了大量涉及病毒结构与致病机理的信息，同样可以确定病人是否感染了病毒，以及是否对病毒有免疫能力。
核酸检测依赖的是引物，病毒蛋白的检测主要依赖抗体。只要找到了亲和力足够高，特异性足够好的抗体，就可以省去提取病毒RNA的繁琐步骤，直接用发病期患者的血清或痰液进行蛋白免疫分析（一般是酶联免疫吸附分析，ELISA），在3-5小时内得到结果。如果采用基于微流控平台的新一代免疫反应器，甚至可以在保证检测灵敏度的情况下，把总检测时间缩短到30分钟之内，真正做到即时诊断。说一句题外话，笔者长期致力于新型微流生物传感器的开发，衷心希望这类新技术能在此次疫情中能起到应有的作用，造福于国家和人民。
基于蛋白的病毒检测开发难点在于抗体筛选生产。实验用抗体的生产高度依赖动物（一般由鼠、兔、羊等动物生产）。注射抗原后数日，还需要对动物的免疫细胞进行筛查，找到能用来生产高特异性抗体的淋巴细胞，对其进行扩增。即便是全速开动，也需要2-3周的时间才能得到初步可用的单克隆抗体。相比基于RNA的PCR试剂盒，蛋白检测试剂盒所需的开发时间要更长，生产成本要更高。
在2003年的非典疫情中，军事医学科学院，中科院北京基因组所，华大基因等单位都开发出了可以检测SARS病毒本身，或患者对病毒免疫反应的ELISA试剂盒。从这次疫情的反应速度上看，预计近期第一批针对新型冠状病毒的蛋白检测试剂盒就将出炉，希望它们能对新型冠状病毒肺炎的诊断起到较大的积极作用。
《光明日报》（2020年02月13日15版）
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