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植物DNA提取过程中,CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)扮演着关键角色。CTAB作为一种阳离子去污剂,能够与核酸形成稳定的复合物。在高盐浓度(超过0.7摩尔/升)条件下,CTAB-核酸复合物溶解度较高,而在较低盐浓度(0.1至0.5摩尔/升)下则会沉淀。通过使用有机溶剂进行抽提,去除蛋白质、多糖及酚类等杂质后,再加入乙醇进行沉淀,即可分离出核酸。CTAB-核酸复合物通过离心弃去上清液,再用70%的酒精浸泡,可以洗脱掉CTAB,进而获得纯净的DNA。
无水乙醇作为理想的沉淀剂,能够安全地与DNA相互作用。当DNA溶液中的水分子被乙醇夺走时,DNA会脱水并易于聚合,从而实现DNA的沉淀。乙醇的这一特性使得它成为植物DNA提取过程中不可或缺的试剂。
氯仿在植物DNA提取过程中主要用于克服酚的缺点,并加速有机相与液相的分层。它在这一过程中扮演着关键角色,有助于DNA的分离与纯化。
[实验试剂]
1)研磨缓冲液:称取59.63gNaCl,13.25g柠檬酸三钠,37.2gEDTA-Na分别溶解后合并为一,用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0,并定容至1000ml。
2)10SSC溶液:称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠,分别溶解,一起定容至1000ml。
3)1SSC溶液:用10SSC溶液稀释10倍。
4)0.1SSC溶液:用1SSC溶液稀释10倍。
5)RNase溶液:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液,用1mol/LHCl,pH至5.0,使用前经80℃水浴处理5min(以破坏可能存在的DNase)。
6)氯仿-异戊醇:按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。
7)5mol/L高氯酸钠溶液:称取NaClO4.H2O70.23g,先加入少量蒸馏水溶解,定容至100ml。
8)SDS(十二烷基硫酸钠)化学试剂的重结晶:将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在70~80℃的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下晾干待用。
9)1mol/LHCl10)0.2mol/LNaOH11)二苯胺乙醛试剂:1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中,添加1.5ml浓硫酸,装入棕色瓶,贮存暗处,使用时加0.1ml乙醛液[浓乙醛:H2O=1:50(V/V)]。
12)1.0mol/L高氯酸溶液(HClO4)
13)0.05mol/LNaOH14)DNA标准液:取标准DNA25mg溶于少量0.05mol/LNaOH中,再用0.05mol/LNaOH定容至25ml,后用移液管吸取此液5ml至50ml容量瓶中,加5.0ml1mol/LHClO4,混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度,则得100μg/ml的标准溶液。
2)将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,加上塞子,剧烈振荡30s,转入离心管,静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。
3)离心成三层,小心地吸取上层清液至刻度试管中,弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。
4)将试管置72℃水浴中保温3min(不超过4min),以灭活组织的DNA酶,然后迅速取出试管,置于冰水浴中冷却到室温,加5mol/L高氯酸钠溶液[提取液:高氯酸钠溶液=4:1(V/V)],使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。
5)再次加入等体积氯仿-异戊醇混合液至大试管中,振荡1min,静置后在室温下离心(4000rpm)5min,取上清液置小烧杯中。
6)用滴管吸95%的预冷乙醇,慢慢地加入烧杯中上清液的表面上,直至乙醇的体积为上清液的两倍,用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。
7)然后加入0.5ml左右的10SSC,使最终浓度为1SSC。
8)重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。
9)加入已处理的RNase溶液,使其最后的作用浓度为50~70μg/ml,并在37℃水浴中保温30min,以除去RNA。
10)加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,在三角瓶中振荡1min,再除去残留蛋白质及所加RNase蛋白,室温下以4000rpm离心5min,收集上层水溶液。
11)再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。
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