电话+V：159999-78052，欢迎咨询dna探针中的荧光基团的位置在哪里，[小程序设计与开发]，[小程序投流与推广]，[小程序后台搭建]，[小程序整套源码打包]，[为个体及小微企业助力]，[电商新零售模式]，[小程序运营推广及维护]
实时定量PCR（real-timePCR），作为定量聚合酶链反应（Q-PCR）的一种创新方法，其核心在于通过监测DNA复制过程中的实时荧光信号来定量分析特定DNA片段。它主要依赖于荧光标记技术，有两种常见应用方式。
首先，一种方法是在双链DNA中嵌入特异荧光染料，如SYBRGreen。这种染料在没有双链DNA存在时不会发光，但当它与双链结合时，荧光信号会被激活。这样，通过监测荧光强度的变化，可以实时追踪DNA的扩增过程。
另一种方式是利用Taqman探针，它是一种带有荧光基团和淬灭基团的寡核酸序列。荧光基团和淬灭基团分别位于探针的5'和3'末端。PCR扩增时，探针会与特定序列结合。在扩增早期，完整的探针会吸收荧光基团的信号。随着扩增进行，探针被切割，荧光基团和淬灭基团分离，释放出的荧光信号可以被检测到。
当实时PCR与逆转录PCR（reversetranscriptionPCR）结合，它能够在极少量的RNA样本中，精确地检测特定时间、细胞或组织中特定基因的表达情况。这种结合应用通常被称为定量逆转录实时PCR（quantitativeRT-PCR），它极大地扩展了基因表达研究的精确度和灵敏度，对于生物学研究和疾病诊断具有重要意义。
RT-PCR为反转录RCR（reversetranscriptionPCR）和实时PCR（realtimePCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭剂则位于3’末端。在PCR扩增过程中，当加入一对引物的同时，会加入一个特异性的荧光探针。探针保持完整时，报告基团发射的荧光信号会被淬灭基团吸收。随着PCR扩增的进行，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。这意味着，每当生成一条DNA链，就会有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
常用的荧光基团包括FAM、TET、VIC和HEX。这些荧光基团具有良好的光稳定性，能够有效增强信号强度，减少背景干扰，提高检测的灵敏度和准确性。
TaqMan探针技术因其高灵敏度和特异性，在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛应用。例如，在基因表达分析、基因突变检测、病原体检测等领域，TaqMan探针技术都可以提供精确的定量数据。
尽管探针本身是由寡核苷酸构成，但它并不直接参与DNA或RNA的合成。TaqMan探针主要用于检测PCR扩增产物，通过其特异性结合和报告荧光信号的变化来实现对目标序列的精确检测。
实时荧光定量PCR（quantitativePCR，qPCR）通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板的定性及定量分析。目前它主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
荧光定量PCR，qPCR
荧光染料法
在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，该染料只与双链DNA小沟结合，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光，因此，在PCR体系中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。
武汉艾美捷科技专注为客户提供整体打包方案，可提供EvaGreen、SolisGreen和SYBR等多种染料qPCR预混液。
EvaGreen、SolisGreen、SYBR染料
荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最丨常用的SYBRGreenⅠ，EvaGreen、SolisGreen属于饱和荧光染料。非饱和荧光染料在浓度高的时候会对PCR过程产生抑制，所以在荧光定量实验时使用浓度稍低，染料不能占据DNA双链上的所有位置。当PCR随着温度上升，双链逐渐解链，染料会从已解开的单链上脱落，然后结合到临近的尚未解链的双链中去继续发荧光。这种染料重排导致在较小的温度变化内，虽然DNA双链的解链过程不同，但荧光值是几乎不变的，也就是说，其溶解曲线不能精确反应双链的解链情况。
所以，对于非饱和染料，其溶解曲线分辨率相对较低，只能区分特异性的产物，不能分辨单碱基的差异。饱和荧光染料在DNA双链中所有可结合位点内都会有染料分子存在，染料与DNA的结合呈饱和状态，随着温度上升，在双链解链、染料脱离过程中，未解链的双链部分不存在染料可以结合的位点，染料不能发生重排。所以使用饱和染料制作的溶解曲线分辨率很高，可以精确反映DNA双链随着温度的解链情况，精度可以达到单碱差异的区分。
荧光标记的探针法
PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号；PCR扩增时（在延伸阶段），Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。
SYBR染料qPCR预混液2.0，QP031
5x多重探针qPCR预混液，08-01-00001
快速探针qPCR预混液，28-21-00001
5×探针qPCR预混液，ROX，QP036
5×qPCR预混液，08-24-00001
染料法VS探针法
1.探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，探针法能够用多重体系反应，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高
2.染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好
文章来源：每日生物评论
欢迎关注微信公众号：每日生物评论，或Bio-review
用最专业的精神，开放性的思维，与你一起探索行业走向，快速了解这个领域！
电话+V： 159999-78052
专注于小程序推广配套流程服务方案。为企业及个人客户提供了高性价比的运营方案，解决小微企业和个体拓展客户的问题
