电话+V：159999-78052，欢迎咨询基因第三代测序分析模板图片大全，[小程序设计与开发]，[小程序投流与推广]，[小程序后台搭建]，[小程序整套源码打包]，[为个体及小微企业助力]，[电商新零售模式]，[小程序运营推广及维护]
深入探索基因世界的奥秘，让我们一起走进基因测序的历程，从第一代Sanger测序到第三代的革命性突破。每一代都在技术的革新中拓宽了我们对遗传信息的认知边界。
第一代基因测序：Sanger测序
Sanger测序，如同一部精密的倒影机器，采用双脱氧链末端合成终止法，从末端开始读取，独特的序列策略使得小片段的序列清晰可见，而大片段则隐藏在序列的尾部，揭示了基因的微观世界。
第二代测序：Illumina的突破
Illumina，科技的璀璨明星，以其独特的步骤引领着测序技术的进步。首先，样本通过文库构建，DNA被打断并末端处理，接着adapter连接，PCR扩增使其数量倍增。然后，这些片段在Flowcell（测序芯片）上形成簇，每个簇代表一个独特的DNA片段。在Sequencing阶段，荧光标记的dNTP以边合成边测序的方式进行，每个碱基的识别就像破解密码，而index则像身份标签，帮助区分不同的样本。
然而，Illumina并非没有局限。PCR扩增可能会引入杂信号，随着测序长度的增长，识别碱基的难度也随之提高。但正是这种挑战，推动了技术的进一步发展。
第三代基因测序：迈向无尽的精度
第三代测序，如OxfordNanopore，以其单分子无PCR的实时特性，引领了一场测序革命。它包括了两类技术：荧光测序和纳米孔测序。单分子荧光测序，如Helicos和PacificBiosciences的SMRT，通过荧光标记直接追踪碱基的每一个跳跃，精度近乎完美。而纳米孔测序，利用电泳和纳米孔的独特特性，像一个微观的生物闸门，精准地分辨出每一个碱基的独特信号，比如牛津Nanopore的ZMWs技术，更是巧妙地降低了荧光背景的干扰。
第三代测序技术的亮点在于其前所未有的速度（比化学法快2万倍）、超长序列测定、近乎完美的高精度（99.9999%），以及对RNA和甲基化DNA的直接检测能力。每一滴基因信息的滴落，都在揭示生命的复杂密码，让我们更深入地理解生命的奥秘。
测序技术是基因组学的核心技术，是基因组学最基本最重要的数据，也是生命科学领域大数据时代的核心组成部分。今天我来简单盘点一代、二代、三代测序技术的优劣势及应用情况。
一代测序是上世纪70年代由Sanger和Coulson开创的DNA双脱氧链终止法测序，也称为Sanger测序。在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174），全长共计5375个碱基。2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
Sanger测序原理：在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。
一代测序虽然准确度十分高，且该技术在当下依然被广泛应用（比如构建载体做克隆，基因敲除等实验都可以用到），但是通量太低，所以对于大片段或者全外显子等非常耗时，且很多情况下成本较高。
二代测序技术，又称为NextGenerationSequencing（NGS）技术，是为了改进一代测序通量过低的问题而出现的，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标。刚面世时主要包括Roche公司的454技术、ABI公司的Solid技术和Illumina公司的Solexa技术。这三种技术都极大的提高了测序的通量，大大降低了测序成本和周期。
其中Illumina公司凭借超低的测序成本和可以接受的读长，成为了目前最主流的二代测序公司，其测序成本近五年来从几千元1G（1G即10亿碱基）降到了到今天的40多块钱1G数据量，这个过程中基因组Denovo测序、转录组测序、小RNA测序、LncRNA测序、circRNA测序、DNA甲基化测序、高密度遗传图谱、大规模GWAS关联分析等等实验手段得到了广泛的推广应用。近年来，NGS技术发展迅速，其应用已进展至临床检测，如无创产前、遗传性疾病，肿瘤（实体/血液）等。
Illumina原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像。
主要步骤：
1、DNA文库制备——超声打断加接头；
2、Flowcell——吸附流动DNA片段；
3、桥式PCR扩增与变性——放大信号；
4、测序——测序碱基转化为光学信号。
二代测序技术虽然通量很高，成本低廉，但是读长实在太短，主流的Illumina测序仪，常规模式只能测PE150的长度，靠着软件算法上的进步才得以可用。由此三代测序走上了历史舞台。
三代测序主要有两种技术：PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies的纳米孔单分子测序技术，这两种技术的测序读长都可以达到几十kb的级别，远远高于二代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。实现了对每一条DNA分子的单独测序。单分子测序可以更准确地检测串联重复扩增等。这对于无参物种的分子生物学研究大有帮助，长读长对于基因组拼接、全长基因序列的获取提供了巨大的便利。
PacificBiosciences公司研发的单分子实时测序系统（SingleMoleculeRealTime，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下：
1、聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部；
2、4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部；
3、荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光；
4、荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基；
5、统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列；
6、酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落；
7、聚合反应持续进行，测序同时持续进行。
但是三代仍然不是完美的技术，其测序错误率相对于一代和二代还是高了很多，另外通量还是远低于二代测序，导致成本也是数倍于二代测序。
测序技术是基因组学的核心技术，上期的推送【LAI：基因组组装质量评估新标准】简单介绍了测序技术的发展进程。其实，测序技术的发展主要基于两个非常具有里程碑意义的理念：“生命是序列的”和“生命是数据的”。序列是基因组学最基本最重要的数据，也是生命科学领域大数据时代的核心组成部分。简单来说，测序技术就是将DNA/RNA分子中碱基ATGC的排列顺序显示出来。
1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构。
DNA双螺旋模型以及“生命是序列的”观点的发表，直接推动了测序技术的发展，因为解读生命遗传信息的前提就是得到它的载体——序列。
从20世纪70年代到现在有很多测序技术和平台的产生，其中包括SBC法、454、IonTorrent、SBL法、Sanger法、Illumina、Pacbio、Nanopore等。今天主要跟大家分享后四种常用的测序技术。
第一代测序技术
Sanger法是基于DNA合成反应的测序技术，又称为SBS法、末端终止法。1975年由Sanger提出，并于1977发表第一个完整的生物体基因组序列。
核心原理：由于双脱氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脱氧，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP，ddCTP，ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影，根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
在每个反应体系中，ddNTP相对于dNTP是很少的，所以只有部分新链在不同的位置特异性终止，最终就会得到一系列长度不一的序列。
第二代测序技术
以Illumina平台为代表的第二代测序技术实现了高通量测序，有了革命性进展，使得大规模并行测序成为现实，极大推动了生命科学领域基因组学的发展。Illumina循环SBS法(cycleSBS)即SBRT(SequencingByReversibleTermination，可逆终止)的核心技术是DNA合成的可逆性末端循环，即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。
基本原理：将dNTP的3'-OH以叠氮集团RTG(ReversibleTerminatingGroup，可逆末端基团)进行修饰；将4种碱基分别与不同的荧光分子连接；DNA合成时，RTG能起到类似于ddNTP的作用终止反应；每次合成反应终止并读取信号之后，洗脱RTG和荧光分子，进行下一轮循环。
主要过程：
a，DNA待测文库构建
利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。这些文库中的DNA在通过flowcell(吸附流动DNA片段的槽道)时会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对，并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。
b，c桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多份拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。
测序方法采用边合成边测序的方法：
1.dNTP模型
2.dNTP加上可终止反应的基团RTG和荧光信号
3. 反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP
4.脱掉-OH和二磷酸，进行合成
5.反应因RTG终止，激发荧光进行信号采集。
6.洗脱RTG和荧光分子，进行下一轮循环
第三代测序技术
以Pacbio平台为代表的SMRT(Single-MoleculeRealTimeSequencing，单分子实时测序)测序技术具有高通量、长读长的特点。
基本原理：Pacbio仍然采用边合成边测序的原理，但实现了两个重要的技术突破。一个是将荧光分子标记在磷酸上，这样在反应停止且捕获荧光信号以后，可直接随磷酸基团脱落，解决了因噪音污染导致的读长很短的问题；二是由于不需要PCR扩增，信号的有效提取成为了关键。通过引入零模波导孔（ZMW）技术解决这一问题。在纳米室底部有一个孔径70nm的小孔，由于远远小于激光的波长，所以激光从底部照射时，只会照亮一个小的区域，提高了信噪比。
主要过程：如下图所示，类似于Illumina部分展示的模式图，也是边合成边测序。
第四代测序技术
纳米孔测序技术是单分子实时测序的新一代技术，主要是通过ssDNA或RNA模板分子通过纳米孔而带来的“电信号”变化推测碱基组成进行实时测序。
基本原理：当纳米孔充满导电液时，两端加上一定电压，分子模板通过纳米孔生成可测量电流。纳米孔的直径只能容纳一个核苷酸，单链模板就会在电场作用下依次通过纳米孔而引起电流强度变化，通过检测相应的电流峰判断碱基，实现实时测序。
四大测序技术的优缺点：
Sanger法测序读长长、准确度高，但是通量不高；
Illumina测序读长短、通量高、准确度高，在进行基因组组装或者结构变异分析的时候没有优势，可用作三四代测序read的纠错；
Pacbio测序读长长、通量高、准确度不高，但可通过测序深度弥补，GC偏差低，可进行甲基化的直接测序。
Nanopore测序读长长、通量高、准确度低，不可通过测序深度弥补，但可通过Illuminaread纠错。
第一、二、三代测序技术都是基于边合成边测序的原理，因此Nanopore技术被一些人（包括我）称为第四代测序技术；
随着测序技术的发展和成熟，逐渐形成基因测序产业链
本期对于测序技术的介绍到此为止，主要是同大家交流学习，欢迎指出不足之处。另外推荐一本2016年出版的杨焕明院士的《基因组学》，非常好的一本书。
电话+V： 159999-78052
专注于小程序推广配套流程服务方案。为企业及个人客户提供了高性价比的运营方案，解决小微企业和个体拓展客户的问题
