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一、重测序-棉花GWAS助力NatureGenetics
GWAS+转录组：从单一组学到组学，为作物育种开启更多的切入点，挖掘作物研究作物研究新亮点。利用多种技术，相辅相成，精确定位基因，层层敲定新基因。
研究背景：对棉花基因组变异分析，有效利用多样性的资源，进一步该县陆地棉的纤维品质和提高产量。
研究方法：针对419份棉花（陆地棉—栽培棉），两年六点共12个环境下对13个纤维相关形状进行表型鉴定。构建350bp文库，基于illumineHiSeq平台测序，平均测序深度6.55X，进行了变异检测、GWAS、转录组等测序分析和qRT-PCR、基因沉默等实验验证。
研究结果：1.基因组变异与群体结构：检测到3665030个SNPs，并通过PCA、系统进化树和群体结构分析可知，419份棉花分为3个亚群（G1\G2\G3），且陆地棉总体上遗传多样性相对低的遗传多样性。
2.13个纤维素相关性状的全基因组关联分析：GWAS共检测到11026个显著关联的SNP、4280个基因（基因——测序后会有相应的注释文件）。并且在转录组中，3089个基因具有较高的表达，可以分为四种模式，分别在发育起始、细胞延伸、和次生壁合成阶段优先表达，另一种模式在多少发育阶段都保持较高的表达水平。
3.开发和纤维发育起始相关的基因挖掘：Dt03染色体上25.56-25.60Mb的关联位点间包含两个候选基因，其中Gh_D03G0728编码COP1互作蛋白1（CIP1）。25.21-25.22Mb位点包含两个候选基因，Gh_D03G0718编码反诉结合酶（GhUCE）。基于这个结果，推测该两个基因与棉花开花和纤维发育起始相关。
4.纤维长度、强度和棉绒相关基因的挖掘：At10上的GhFL1和Dt11上的GhFL2是一种控制纤维长度的新基因。Gh_A07G1769是编码纤维强度的基因，而Gh_D02G0025可能通过不同的激素信号通路参与纤维起始和快速伸长，并决定棉绒量。
5.显著关联位点的驯化选择：在7383个显著关联的SNP中，有5733个优异等位基因，优异基因的等我基因频率在从野生稻稻早期栽培驯化品种的驯化过程，和从早期到现代的栽培品种，都增加了。结果说明了对重要经济性状的表型选择使优异等位基因被保留，并为驯化和育种提供了分子依据。
研究结论：对419份棉花进行重测序，并对13个性状进行GWAS分析，鉴定出了与开花时间、纤维长度和纤维强度有关的新基因，并且发现棉花驯化和育种过程对纤维相关性状的选择，增加了优异等位基因频率。为分子标记选择和棉花遗传改良提供了可靠的参考依据。
二、—本生烟的前世今生
TheRiseandRiseofNicotianabenthamiana:APlantforAllReasons
本生烟（Nicotianabenthamiana）原产于澳洲，与辣椒、番茄、马铃薯及栽培烟草等一样，归属于茄科，是含有19条染色体的异源四倍体植物。近十几年来，因其在植物-微生物互作、鉴定蛋白质相互作用及亚细胞定位、代谢调控、疫苗生产及合成生物学方面的广泛应用，本生烟被认为是除拟南芥之外的重要模式植物。
现在世界范围内主要应用的本生烟源于澳洲，而关于其具体来源，目前还有所争议。世界上关于本生烟的最早记录在1839年11月，澳洲西北部地区，最早期相关样本被保存在英国皇家植物园Kew（样本编号:K0001961）。Goodin等人收集了5个研究所（分别来自西班牙、英国和美国）的11个本生烟株系进行RFLP分子鉴定后发现，除一个株系外其余均来自于同一遗传背景，但与Kew保存的本生烟不同。近期，澳洲阿德莱德大学与美国加州大学伯克利分校的J.Cleland与T.H.Goodspeed教授之间的书信往来显示（图1），1936年收集于澳洲中部的本生烟种子于1939年被转移到美国，而其基因组信息99%与目前美国及欧洲大部分实验室使用的本生烟品系基因组相似，这些证据表明，澳洲Granites区域（南纬20.57，东经130.35）极有可能是世界上各实验室使用的本生烟发源地。
图1.澳洲阿德莱德大学与美国加州大学伯克利分校的J.Cleland与T.H.Goodspeed教授之间的书信档案。
在澳洲，本生烟主要有6大地理分布（图2），有330个左右经过正式鉴定并保存的株系样本，Bally等人通过不同地理位置分布，将澳洲本生烟进行了不同命名，如实验室使用株系（LAB）、NorthernTerritory（NT）、NorthWesternAustralia（NWA）、WesternAustralia（WA）、Queensland（QLD）、及SouthAustralia（SA）等。这些株系之间在植物株型、叶子形状、授粉状况、花形及种子大小等生长与发育上有一定差异（图3）。从形态上，SA株系与实验室使用株系LAB较相似。通过核酸信息进化树分析，也发现LAB株系与SA株系相近。因此，目前实验室主要使用的LAB株系可能来自于澳洲的Granites地区，并在世界范围内大量使用，遗传背景较为一致，而这也为利用本生烟作为工具进行科学研究提供了较高的可比与参考性。
图2.澳洲本生烟主要品系地理分布。LAB，实验室株系;NT，NorthernTerritory;NWA，NorthWesternAustralia;QLD，Queensland;SA，SouthAustralia;WA，WesternAustralia.
图3.澳洲不同地理分布的本生烟生长发育对比。
本生烟在世界范围内被广泛应用，主要因为它具有以下优良性状：①实验室培养条件下容易大量种植并利于收集大量植物材料；②与拟南芥、水稻等模式植物相似，具有植物体内基因表达调控及蛋白翻译后修饰，比在大肠杆菌或酵母表达体系中进行功能验证更直接；③对已知大部分已经鉴定的植物病毒敏感，可以直接进行植物-病原微生物互作功能研究；④农杆菌介导的基因瞬时表达体系成熟，可以直接进行基因调控，蛋白质互作及定位等分子生物学与生物化学功能研究。
01基于植物病毒的表达体系
本生烟自身对多种植物病毒非常敏感（图4），基于此开发了病毒介导的基因表达工具，利用病毒载体在本生烟中表达不同蛋白进行功能研究。随着农杆菌T-DNA介导基因表达技术发展，在本生烟中瞬时、快速、大量表达外源蛋白进行功能研究变得更加便利，而基于病毒改造的植物表达载体也被广泛应用。通过病毒介导的基因沉默（virus-inducedgenesilencing，VIGS）技术可下调植物内源基因表达，在烟草、拟南芥、苜蓿、番茄、辣椒、大豆、棉花、草莓等双子叶植物及玉米、大麦、小麦等单子叶植物中均有广泛应用。而本生烟中VIGS也是应用最为广泛，基因沉默效果最好，最为便捷的遗传工具。
图4.不同本生烟株系在病毒侵染后反应。（a）LAB株系接种PVX-GFP病毒20天反应，绿色荧光显示了马铃薯X病毒在本生烟体内扩散情况；（b，c）16c本生烟PVX-GFP侵染前后情况；（d）WT本生烟中PVX-GFP侵染后不同时间情况；（e）不同本生烟株系在病毒侵染后反应。
0216c-转基因烟草经典之作
由英国剑桥大学DavidBaulcombe教授实验室出品的GFP转基因本生烟16c满足了植物学研究领域大部分需求。16c本生烟中GFP稳定表达，因其GFP荧光信号易于追踪检测等特点，被广泛应用于RNAi/VIGS、表观遗传、植物-病原微生物互作、分子移动、嫁接、蛋白质结构与功能、蛋白质互作、基因沉默与抑制等多领域与方向，利用16c作为材料产生的相关论文有超过750篇之多。
03本生烟与细胞生物学
蛋白在植物体内细胞定位对于研究蛋白功能尤为重要，而利用农杆菌T-DNA介导的瞬时表达体系大大缩短了研究蛋白细胞定位的周期，构建荧光蛋白稳定表达拟南芥或其他植物品系可能需要数月至数年之久，而利用农杆菌在烟草中瞬时表达可以缩短到一周之内。随着不断开发的各种荧光蛋白，如常见GFP、RFP、YFP、CFP等，及不同荧光染料，如DAPI及FM-64等，实时可监控地研究蛋白质亚细胞定位时空动态成为现实（图5），基于不同荧光蛋白的不同亚细胞定位marker蛋白也被广泛应用于本生烟表达系统中，通过共定位进一步确定目的蛋白亚细胞定位情况。
图5.不同荧光蛋白标记的不同蛋白在本生烟叶肉细胞中定位。
04本生烟与蛋白质互作
本生烟在植物学研究中最为关键的应用就是利用农杆菌介导瞬时表达系统研究蛋白质-蛋白质相互作用，主要技术体现在：①基于免疫沉淀的Co-IP、IP-MS/MS技术等；②基于双分子互补技术的BiFC、Split-LuciferaseComplementation等；③基于荧光蛋白能量转移FRET技术的FRET-FLIM等。此外，通过添加激素、小肽、蛋白质合成与降解抑制化合物等小分子化合物可以进一步检测蛋白质实时互作动态，大大加速对蛋白互作网络、生物化学功能研究。
05本生烟与生物制剂
除了进行生物学研究，本生烟被广泛应用于生物制药行业，例如制造抗体等药物，目前已用于流感病毒、埃博拉病毒、登革热病毒、HIV/AIDS、甲乙丙肝病毒、SARS、西尼罗河病毒等多种病毒抗体制备研究。其中较为人知的是2014年两例美国用于治疗埃博拉病毒患者的ZMapp抗体药物，就含有本生烟表达体系产品（图6）。同时，科学家也发现植物中蛋白的翻译后修饰，如糖基化，会使部分人产生过敏反应，这也限制了利用本生烟大量生物制剂的应用与发展。随着生物技术的不断发展，科学家正在尝试调控本生烟中蛋白翻译后修饰来生产符合人体利用的生物制剂，如将抗体定位在ER上进行表达以减少糖基化修饰，敲除或者沉默糖基转移酶，及共表达哺乳动物源的糖基化酶等，上文提到的ZMapp就是经过糖基化修饰调整后的抗体药物。
图6.ZMapp抗体药物大致流程图(askabiologist.asu.edu/e...)
棉花中的钙依赖性蛋白激酶：深入了解植物对盐胁迫的早期反应
原创2023-07-2121:00·名城雨文|名城雨编辑|名城雨
土壤盐碱化是全球作物生产的主要环境制约因素之一。盐分在耕地中的积累导致植物形态和生理的有害变化，导致作物质量和产量急剧下降。迄今为止，约三分之一的农田受到一种或多种盐碱化的威胁。土壤中盐浓度高的原因很复杂，包括干旱气候、地下水位高、海水渗入等。根据全球气候变化模式和灌溉实践，盐胁迫对作物生产的不利影响预计将在不久的将来增加。植物已经开发出重要的防御反应，使它们能够在恶劣的环境中生存和繁殖，可以在暴露于高盐度环境后的几分钟到几周内被激活。对盐胁迫的初始感知和响应是植物在盐渍土壤中切换到抵抗状态的关键步骤。在此步骤中，有毒离子（主要是Na和Cl+?）通过根部进入，导致水分流失和膨胀压力增加。
此外，涉及快速和长距离信令的一系列信令网络可能被激活或抑制。扩大的研究表明，在植物反应的早期阶段，一些信号事件参与其中，包括钙（Caa2+）感知、活性氧产生和蛋白质磷酸化。尽管已经对这一主题进行了深入研究，但早期植物对盐胁迫反应背后的机制尚不清楚。钙2+被表征为保守的第二信使，在利用钙的植物中的信号感知和转导中起着至关重要的作用2+-依赖信号网络。Ca的瞬时和微小变化2+由细胞外刺激引起的钙可以感知2+传感器或钙2+-结合蛋白质并导致下游因子的强烈反应。
钙依赖性蛋白激酶（CPK）作为众所周知的钙2+-传感器蛋白，形成植物中最大和分化的基因家族之一。CPK蛋白由四个特征结构域组成：高度可变的N末端结构域，催化Ser/Thr激酶结构域，自身抑制区域和保守的调节钙调蛋白样结构域（CaM-LD）。结合钙的C端CaM-LD2+具有EF手结构，使CPK功能在信号感知和转导以及涉及Ca的植物响应中2+。CPK已被许多植物物种表征，CPK蛋白在不同的组织和细胞器中表现出非常特异性的分布，这与它们实质上分化的功能相匹配。据报道，CPK在植物对盐胁迫的反应中起着重要作用。例如，CDPK1和CDPK1a可以激活玉米原生质体中的干旱和高盐胁迫诱导启动子，表明CPK参与植物对盐胁迫的信号响应。OsCPK7和OsCPK12是水稻中两种正调节剂的耐盐性。OsCPK7主要在维管束中表达，当水稻植物受到盐胁迫和干旱胁迫时，水分胁迫最为严重。过表达OsCPK7的转基因水稻显示出对盐的抗性增加，以及对一些应激反应基因（如rab16A）的增强诱导。OsCPK12通过上调ROS清除酶（OsAPx2和OsAPx8）和抑制应激诱导的ROS过量产生来促进盐胁迫反应。
OsCPK12的表达与水稻的耐盐性密切相关，OsCPK12发生突变，RNA干扰导致对盐胁迫的耐受性降低。AtCPK23参与对非生物胁迫的反应;cpk23突变体对干旱和盐胁迫的耐受性大大增强，而过表达AtCPK23的幼苗与突变体相比表现出相反的表型。几种CPK调节离子通道活性[11]，拟南芥的AtCPK3，4，5，11和29能够在体外磷酸化AtTPK1，这是一种控制K外排和气孔运动的空泡K通道。植物CPK还参与对ABA、ROS等重要信号分子的转录反应。尽管CPK参与植物对盐胁迫的反应进行了大量工作，但它们在早期信号事件中的参与仍有待阐明。棉花是一种全球栽培作物，具有重要的农业和经济意义，是纤维和油的主要来源。棉花的生产力和质量受到恶劣环境的不利影响。持续的土壤盐碱化过程限制了耕地。因此，全球对棉花的需求令人担忧，需要开发在盐碱环境中提高生产力的新棉花品种。
尽管已经确定了来自不同植物的CPK，并探索了它们在植物发育或胁迫响应中的调节机制，但对棉花中CPKs响应盐胁迫的传感和调控网络知之甚少。据报道，唯一具有功能性特征的棉花CPKGhCPK1在纤维发育中诱导钙信号传导并发挥作用。最近，据报道拟南芥的CPK11可以在体外磷酸化棉花植物干旱诱导的蛋白质19（GhDi19-1和GhDi19-2）。不幸的是，激活这些蛋白质的内源性棉花CPK尚未得到研究。对陆地棉（棉）品种“TM-1”的完整基因组进行测序和释放，该基因组为异体四倍体棉花中CPK基因家族的全基因组鉴定提供了必要的数据。
通过使用公开的数据库结合生物信息学鉴定了98名来自毛茛的假定CPK成员，然后我们分析了它们在不同器官中的表达模式以及对盐胁迫和植物激素治疗的反应。盐胁迫下的表达和聚类分析显示，19个CPK基因转录本的早期积累，在盐处理后1h内急剧增加。因此，这些CPK基因可作为多毛葡萄球菌盐胁迫的重要指标。研究结果为棉花CPK的进化和功能以及培育抗盐棉花品种的候选基因提供了重要见解。CPK蛋白在进化上是保守的Ca。2+感觉蛋白参与调节植物对各种刺激的反应。在整个进化过程中，CPK成员的数量大幅增加，导致不同物种中具有不同功能的同系物多样化。推定的CPK是通过搜索同种异体四倍体（AADD基因组）陆地棉花品种“TM-1”的棉花基因组数据库来确定的，该数据库使用拟南芥、水稻、玉米和葡萄的CPK序列构建。所有推定的CPK都进一步进行了Pfam和SMART分析，以识别其保守结构域和签名序列。同时具有Ser/Thr激酶结构域和CaM-LD的候选物被认为是棉花CPK蛋白。分别从雷蒙迪二（DD基因组）和植物园（AA）的二倍体棉花基因组中鉴定出41个和43个CPK。
经过这种筛选方法，共确定了98个推定的CPK，并根据其入藏号命名为CPK1至CPK98。G.hirsutum的CPK数量超过了G.raimondii和G.arboretum的总和CPK。异体四倍体棉起源于具有A和D基因组的物种间的种间杂交，表明CPK家族基因从二倍体棉向异体四倍体棉的扩增主要是多毛苣苔在进化过程中四倍体化的结果。98个棉花CPK基因编码的蛋白质长度从264到1191个氨基酸不等，预测的等电点（pI）范围为4.92至9.28，分子量（Mw）为29.75至134.30kD。CPK的变异反映了它们多样化的细胞功能，并且与其他物种的先前报道一致。
MEGA6.0用于生成无根系统发育树，以对G.hrisutum的CPK进行分类，并研究它们与拟南芥同系物的进化关系。根据序列保守，将棉花中鉴定出的98个CPK分为1组。
棉花CPK基因的序列比对和系统发育分析结果显示，基因重复是该家族的常见现象。例如，GhCPK69和GhCPK98在其蛋白质序列中共享1.3%的身份，并且预测具有相似的pI和Mw值，只有少数单核苷酸多态性（SNP），这在非功能区域中观察到。GhCPK6位于A06染色体（入藏号A1772G69）上，GhCPK6位于D06染色体上（入藏号D2206G21）。因此，GhCPK69和GhCPK14是来自两个不同亚基因组的同系物。同样，四个高度同源的成员（GhCPK22，GhCPK63，GhCPK70和GhCPK91）共享超过14.4%的氨基酸序列同一性。
这些结果表明，多倍体化在棉花中复制了相当数量的CPK基因。这可以解释棉花中相对于其他植物物种的大量CPK，即拟南芥中的5个CPKs，水稻中的6个CPKs和玉米中的7个。在这29个组中，II组是棉花和拟南芥中最大的组，包含28个棉花CPK，占拟南芥CPK总量的三分之一以上。I、III和IV组分别包括20、21和3个棉花CPK。
根据之前的研究，IV组是最小的组，分别仅包含来自拟南芥的5个CPK，6个来自水稻，7个来自玉米和9个来自葡萄。在这里，我们发现2种棉花CPK被归类为IV组。上述结果表明，除了全基因组复制外，其他进化事件也对棉花CPK的数量做出了贡献。
为了研究这些CPK基因的染色体位置，我们分析了已发表的G.hirsutum基因组的26条染色体。26条染色体被标记为A01至A13和D01至D13。使用CPK基因的基因组序列与BLAST查询基因组，以评估其基因组分布。98个CPK基因定位于26条染色体。棉花CPK基因的分布模式是非随机的，大多数同源基因在A和D基因组之间均匀分布。然而，每条染色体的CPK基因数量分布不均匀。例如，A11和D11分别包含六个CPK，但只有一个CPK基因定位于染色体A03。几个CPK似乎聚集在特定染色体上，例如染色体A09和D09。
CPK基因的功能多种多样。CPK基因通过调节钙信号通路的下游成分来影响植物盐抗性。同样，它们还参与耐寒性，病原体防御，激素反应等。第4簇中具有代表性的棉花CPK基因被证实具有正向调控耐盐性，这与它们表达谱和蛋白质定位模式的累积证据一致。然而，CPKs的下游成分，以及棉花中的生理适应机制及其对盐的反应，仍有待在未来的研究中研究。G.hirsutum基因组包含98个假定的CPK，它们广泛分布在基因组中。表达谱鉴定出19个在盐胁迫早期具有显著诱导基因表达的CPK，其中15个通过qPCR进一步证实。
有趣的是，13个CPK中有15个在暴露于乙烯释放化学物质ETH时也表现出强烈的诱导，这表明它们可能参与了盐胁迫和乙烯信号网络之间的串扰。所有研究的CPK都位于质膜上，与细胞信号传导中的可能作用一致。一些CPK的沉默严重损害了棉花对盐胁迫的基础抵抗力，表明它们参与了抗性机制。本研究旨在拓宽我们对CPK功能的认识，为进一步研究棉花响应盐胁迫的分子机制提供重要见解，并为提高棉花耐盐性提供候选靶基因。
参考文献
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【6】SimeunovicA，MairA，WurzingerB，TeigeM.了解您的客户在哪里：亚细胞定位和钙依赖性蛋白激酶的靶标。JExpBot.2016;67(13):3855–72.
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