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本文介绍了PCR的详细操作流程，强调了实验中的注意事项，列举了常用缓冲液的配方。帮助我们在理解实验的基础上更顺利的操作。
聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外合成双链DNA的一种方法，其原理类似于天然DNA的复制过程，其特异性主要依赖于与其目的片段两端互补的特异引物和高特异性的酶（热启动酶）。典型的PCR反应有三个步骤：变性，退火，延伸，经过多次循环反应，获得目的片段。
一．试剂准备
1.DNA模板
2.特异性引物
3.dNTPMix
4.PCRbuffer
5.热启动酶
二．操作步骤
1.配置反应体系
将各成分依次加入到0.5ml的离心管中
扩增使用热启动酶，可在常温下操作，非热启动型的酶要在低温配置反应体系。
2.按照试剂盒说明书设置反应时间和温度，扩增结束后电泳鉴定
3.琼脂糖核酸电泳
·将电泳所用器具蒸馏水洗净，架好梳子
·根据要分离的DNA片段大小制备合适浓度的琼脂糖凝胶，准确称取一定的琼脂糖加入到锥形瓶中，加入30ml左右的电泳缓冲液（TAE或TBE）
·在微波炉中加热融化后冷却至40℃左右，充分混匀后倒入电泳槽中
·室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样
·在电泳槽中加入电泳缓冲液，漫过凝胶表面即可，点样孔内不要有气泡
·样品点样前准备好，（在八连管中）加入5ul样品，1ul的6xLodingbuffer和1ul的染料混合，用抢将混合后的样品缓缓注入到点样孔中，注意不要串孔
·按照正负极（红正黑负），接通电源，电压40-60V，时间30-40min，可根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳
·电泳结束，关闭电源，凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小
不同的琼脂糖浓度分离不同大小的DNA片段：
三．注意事项
引物
引物是决定PCR反应成败的关键，要保证扩增的准确、高效，引物的设计要遵循如下原则：
1.引物的设计在cDNA的保守区域，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析的软件，得到不同基因相同的序列就是该基因的保守区
本文详细阐述了PCR技术的操作流程，重点讲解了实验过程中需要注意的事项，并列出了常用的缓冲液配方。通过理解实验原理，可以使操作更加顺畅。
聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是一种在体外合成双链DNA的方法，其原理与自然DNA的复制过程相似，特异性主要取决于特异引物和与其目的片段两端互补的高特异性酶（热启动酶）。经典的PCR反应分为变性、退火、延展三步，通过多次循环反应获得目的片段。
I试剂制备
一、DNA模板
2.特定引物
3.dNTPMix
4.PCRbuffer
五、热启动酶
第二步：行动
1.构建反应系统
在0.5ml的离心管内依次加入各组分
采用热启动酶进行扩增，使其在常温下运行，非热启动酶在低温配置反应体系。
根据试剂盒说明书设定反应时间和温度，扩增结束后进行电泳鉴定
三、琼脂糖核酸电泳
把电泳所用的器皿蒸馏水清洗干净，把梳子固定好
以待分离DNA片段的大小为基础，制备适当浓度的琼脂糖凝胶，精确称取一定数量的琼脂糖，加入锥形瓶，并加入约30ml电泳缓冲液(TAE)
用微波炉加热熔化，冷却至40℃左右，充分混合后倒入电泳槽
在室温下进行40分钟的凝固，小心地拔出梳子，将凝胶放入电泳槽准备点样
向电泳槽内加入电泳缓冲液，漫过胶体表面即可，点样孔内无气泡
点样前准备好，（在八连管中）加入5ul样品，把1ul的6xLodingbuffer和1ul的染料混合，用抢把混合的样品缓慢地注入点样孔，注意不能有串孔
按正负极(红，黑，黑)接通电源，电压40-60V，时间30-40min，根据溴酚蓝的位置可判断电泳是否终止
结束电泳，关闭电源，观察凝胶成像，通过marker对比确定碎片的大小
3.注意事项
引子
引物是PCR反应成功与否的关键，为了保证扩增的准确性和效率，引物设计应遵循以下原则：
一、引物设计：在NCBI上搜索不同物种的相同基因，通过序列分析软件得到相同基因的序列，即为该基因的保守区。
二、引物长度：15-28bp，大于38bp时，退火温度升高，不利于普通Taq酶扩增
3.引物中GC的含量为40%-60%，Tm最接近72℃
四、由于密码子的简并性，引物的3’端最好避开密码子的第三位（最好是T）
五、碱基分布不均匀，3’端不超过3G或C
6.引物本身不形成发夹结构，引物设计完整，要通过BLAST验证
PCR扩增对模板要求不高，可以采用单链或双链DNA作为扩增片段，但PCR可以扩增少量的DNA，为保证扩增的专一性，对不同来源的模板，起始浓度有一定要求，如下：
模版可以是纯化过的样品，也可以是粗制滥造的样品，不同来源的模版采用不同的处理方法，试验模版纯化越简单越好，但模版中若有Taq酶抑制剂，蛋白酶，核酸酶等，会干扰反应。取模时要注意保存，不要放置过久，避免反复冻融，防止降解。大多数人都会忽略这个问题，当实验结果不带条纹时，可以优先考虑是否是模板降解的原因。
实例：细菌DNA提取法
取1-2ml菌液，离心12，000rpm10min，除去上清，得到沉淀
2.根据得到的沉淀量，加入约500ul的TE(以下是配方)悬浮沉淀，并加入20ul溶菌酶，30min37度保温
3.加入10%的30ul的SDS和1mg蛋白酶K，混合后1h37度保温
5mol/l氯化钠的添加量为120ul，完全混合，65度置10min
5.等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)充分混合后，12，000rpm离心5min，在干净的EP管中得到上清
6.等体积氯仿：异戊醇(24:1)充分混合，12，000rpm离心5min，得到上清于速凝胶管
7.加入等体积的异戊醇，充分混合，-20℃置入30min，10，000rpm，离心5min
8.除去上清液，得到DNA沉淀用70%乙醇漂洗(动作轻柔，不产生沉淀)，吸干，通常可得到3-5ugDNA
其他
1.TaqDNA聚合酶：Taq酶有多种种类，热启动酶、高保真酶，根据各自实验的应用选择适当的酶扩增，一般反应中，热启动酶经化学修饰后即可顺利完成，热启动酶的化学修饰可以避免在低温下产生任何非特异性的产物。酵素浓度对扩增效果有一定影响，酵素用量过大，会产生非特异性产物，请遵照使用说明。
2.dNTP：四个dNTP的浓度是一样的，如果其中任何一个浓度过高或过低，就会引发错误的碱基渗透。另外，dNTP还可以与该体系中的镁离子结合，从而影响该体系中镁离子的含量。
三、缓冲液：缓冲液通常与酶一起供应，一般PCR试剂盒包括酶、缓冲液、dNTP、水。初始扩增，可完全按照试剂盒说明书进行操作，若扩增结果有问题，可自行摸索实验条件或重新设计引物提取模板。
由于空气中和手部有污染源，操作时应戴手套，在清洁的环境下配置反应系统，以防止空气中的污染源。
五、PCR扩增的水要经过高压消毒或0.2um滤膜过滤。
6.产物切胶在回收二次扩增之前，首先对二次扩增模板进行1000倍稀释。
4.常用试剂的配方
电泳缓冲液
1.50xTAE(pH8.5)
取Tris242g，EDTA(Na)37.2g在1L烧杯中，加入800ml去离子水，搅拌溶解，将57.1ml乙酸充分搅拌，调至pH值8.5，定容至1L，室温保存。每一次都会稀释。
2.10xTBE(pH8.3)
取Tris108g，EDTA7.44g，硼酸55g于1L烧杯中，加入800ml去离子水，充分搅拌溶解，调至pH8.3，定容至1L，常温保存。稀释每一次使用前。
上层缓冲液
6xLodingbuffer
二甲苯青0.25%，溴酚蓝0.25%，甘油30%在双蒸水中保存，温度4℃。
本试剂盒用于定性检测人非小细胞肺癌、结直肠癌和乳腺癌等癌症患者中PIK3CA基因突变，产品包含独家稳定剂，在达到1%高灵敏度的前提下，仍可保证高特异性，避免假阳性。检测结果可供医生在非小细胞肺癌患者中选择适合吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼；结直肠癌患者中选择适合爱必妥（西妥昔单抗）和维克替比（帕尼单抗）；乳腺癌患者选择适合赫赛汀（曲妥珠单抗）等靶向药物治疗的人群时参考。检测结果仅可用于临床参考，不可作为诊治的唯一依据。仅可用于体外检测。
ARMS-PCR法
本试剂盒采用ARMS-PCR法，检测PIK3CA基因9、20号外显子5种热点突变（约占80%~90%）。研究表明：PIK3CA基因发生突变时，患者往往无法从抗EGFR、HER2的治疗中获益。
IR-IC双质控
除阳性质控（PC）和阴性质控（NC）外，本试剂盒精心设置了内参基因（InternalReference，IR）和内控基因（InternalControl，IC）双质控检测体系，可以分析待检DNA能否被正常扩增，排除可能造成PCR失败的原因，保证实验的可靠性和可追溯性。
产品特点：
选择性高可检测多种样本，低至5ng/μlDNA中1%的突变
灵敏度高目标基因仅需达到几百拷贝即可检出
特异性高检测野生型样本时，扩增曲线平整
操作便捷预装试剂，加样后即上机反应，便于实验室标准化操作
方便快速适用于多种PCR仪器，90分钟完成上机检测
稳定可靠闭管反应，IR-IC双质控，避免假阴性、假阳性
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