pcr扩增仪波长和通道的关系图分析

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一、qpcr数据分析及作图方法

qPCR数据分析及作图方法包括以下步骤：

首先，理解△△Ct法的原理【△△Ct法原理】。这种方法主要依赖于Ct值来计算结果，因此，在qPCR运行结束后，除了Ct值，其他数据通常在后续分析和计算中不会被使用。这一方法假设目的基因和内参基因的扩增效率是基本一致的。

二、荧光定量pcr原理

荧光定量PCR原理：

随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

荧光定量PCR最早称TaqManPCR，后来也叫Real-TimePCR，是美国PE（PerkinElmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的PCR产物量也不能计算出起始DNA拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。

荧光域值（threshold）

是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即threshold。

Ct值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。


Ct值与起始模板的关系：

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如下图所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量检测

荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；

荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBRGreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LCGreen等。

嵌合荧光染料法（SYBRGreenⅠ）

SYBRGreenI是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。

揭晓你所不了解的第三代测序技术

什么是第三代测序技术？

第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。如果你还记得，我们之前说过二代测序之所以要进行PCR扩增是为了放大信号，而在第三代测序里，在没有进行PCR扩增的情况下，是怎样做到对碱基信号的识别的呢？本文为你揭晓。

第三代测序技术原理

第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：

第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国HelicosBiosciences的SMS技术和美国太平洋生物（PacificBiosciences）的SMRT（singlemoleculereal-time，SMRT）技术。HelicosBiosciences公司虽然第一个成功的开发了单分子测序技术，但未能解决读长的问题，最后公司运营失败，被迫在2012年关闭。所以，目前所剩的第三代测序技术只有PacificBioscience公司推出的单分子实时DNA测序仪。其实纳米孔测序（nanoporesequencing）在国外也被称为第三代测序技术，但是国内大家喜欢把它列为第四代测序技术。

Pacbio的测序原理是：DNA聚合酶Phi29和模板结合，4色荧光标记4种带荧光集团的碱基（即是fluoro-dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。

当加入的碱基与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

同时这DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。

第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法（nanoporesequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。

由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。

SMRT测序技术的关键技术

第一：因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。

PacificBiosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-modewaveguides（ZMWs）]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。

而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止。

此外，小孔直径也有考究，如果直径大于微波波长，能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长，能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理），从而可起保护作用。

ZMW（零模波导孔），外径100多纳米，比检测激光波长小（数百纳米），激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围里，正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。

第二：共聚焦显微镜实时地快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。

第三代测序技术特点

1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。

2、它实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。

3、直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。

4、第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。

第三代测序技术的应用

1基因组测序。

由于具有读长长的特点，SMRT测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig数量，明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节省大量的时间。相对NGS的优势就是能更快获得结果，因此该系统在鉴定新的病原体和细菌的基因组测序方面得到很广泛的应用。

由于其通量还很低，所以测人全基因组的话，目前费用还非常高。

2甲基化研究。

SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法，聚合酶合成每一个碱基，都有一个时间段，而当模板碱基带有修饰时，聚合酶会慢下来，使带有修饰的碱基两个相邻的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的比值如果大于1，由此就可以推断这个位置有修饰。

3突变鉴定（SNP检测）。

单分子测序的分辨率具有不可比拟的优势，而且没有PCR扩增步骤，就没有扩增引入的碱基错误，该优势使其在特定序列的SNP检测，稀有突变及其频率测定中大显身手。

例如在医学研究中，对于FLT3基因是否是急性髓细胞白血病（AML）的有效治疗靶标一直存在质疑。研究人员用单分子测序分析耐药性患者基因，意外发现耐药性与FLT3基因下游出现的稀有新突变有关，重新证明了FLT3基因是这种最常见白血病—急性髓细胞白血病（AML）的有效治疗靶标，打破了一直以来对于这一基因靶标的疑惑。凭借PacBio平均3000bp的读长，获得了更多基因下游的宝贵信息，而基于单核酸分子的测序能够检测到低频率（低至1%）罕见突变，正是这项成果的关键所在。

第三代测序技术的缺陷

1SMRT技术的缺陷。

SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%。

SMRT技术的缺陷是会出现插入和缺失错误。缺失错误源于有时候碱基掺入速度过快，超过了相机的拍摄帧数；插入错误源于有时候酶随机的选择一些碱基，但并未真的将这些碱基掺入合成链中。

但这些错误是随机的，并不会随着读长的增加而提高，随着测序覆盖深度的增加会逐渐被消除。未来随着试剂的不断优化以及每个SMRT孔可获得的数据量的增加，单分子测序的原始准确度会逐步提高，且也会进一步提高。

2纳米孔技术缺陷。

纳米孔单分子测序技术的一大优势就是仪器构造简单使用成本低廉；因为它不需要对核苷酸进行标记，也不需要复杂的光学探测系统（如激光发射器和ＣＣＤ信号采集系统等），能直接对ＲＮＡ分子进行测序。同时由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流，因而能对修饰过的碱基进行测序，这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值；缺点就是它采用的是水解测序法，不能进行重复测序，因而无法达到一个满意的测序精确度，通量目前也非常小。

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